Câu chuyện của Assassin’s Creed xoay quanh cuộc chiến kéo dài hàng trăm năm giữa hai phe thù địch: Hội Hiệp sĩ Thánh chiến và Hội Sát thủ. Hội Hiệp sĩ Thánh chiến là một tổ chức bí mật, quy tụ những người có tài năng và địa vị cao trong xã hội, với mong muốn xây dựng một thế giới không còn xung đột, bạo lực. Họ quyết tâm thực hiện lý tưởng của mình bằng cách thống trị tuyệt đối, không ngần ngại loại bỏ những ai có ý kiến trái chiều.
Hội Hiệp sĩ Thánh chiến luôn tìm kiếm Quả táo Vườn Địa Đàng – một thánh vật huyền bí mà họ tin rằng có khả năng giúp họ kiểm soát toàn nhân loại. Ngược lại, Hội Sát thủ đứng lên để bảo vệ sự tự do của con người trước các âm mưu độc tài của Hội Hiệp sĩ. Họ âm thầm hoạt động trong bóng tối để bảo vệ ánh sáng, trở thành đối thủ không đội trời chung với Hội Hiệp sĩ.
Trong thế giới hiện đại, có một tử tù tên là Callum Lynch (do Michael Fassbender đóng) đang chờ giờ hành quyết. Sau khi bị tiêm thuốc độc, anh bất ngờ tỉnh dậy tại một cơ sở nghiên cứu của Abstergo Industries ở Tây Ban Nha. Thật ra, Abstergo chính là tổ chức hiện đại của Hội Hiệp sĩ Thánh chiến, tìm kiếm Quả táo Vườn Địa Đàng bằng cách khám phá ký ức của các sát thủ thông qua hậu duệ của họ.
Sophia Rikkin (Marion Cotillard), người đứng đầu nhóm nghiên cứu tại Abstergo, cho Callum biết rằng anh là hậu duệ cúu của Aguilar de Nerha, một sát thủ sống vào thế kỷ XV ở Tây Ban Nha. Sophia tin rằng Aguilar là người đã sở hữu Quả táo và biết vị trí ẩn giấu của nó. Với sự trợ giúp của thiết bị mang tên Animus, Callum có thể trải nghiệm lại ký ức của tổ tiên thông qua mã di truyền của mình, từ đó tìm hiểu về lịch sử của dòng họ sát thủ.
